Microrganismi e metodi di rilevamento

Preparazione dei campioni di prova per i rilievi microbiologici

Riferimento UNI EN ISO 6887-4:2004 Parte 4: Regole specifiche per la preparazione di prodotti diversi dal latte e dai prodotti del latte, dalla carne e prodotti a base di carne, dai pesci e prodotti della pesca.

Prelevare in condizioni di sterilità campioni di 25 g di materiale vegetale e omogenare in 100 ml di acqua peptonata sterile (diluendo 1:5 il campione iniziale) a pH 6,8 (1 gr peptone; 8,75 g K2HPO4; 0,5 g KH2PO4; H2O quanto basta per 1 litro) per 60 secondi a velocità normale in sacchetti di polietilene in un New Stomacker 400, modello BA7021 (Lab Blender). L’acqua peptonata favorisce la rivitalizzazione delle cellule batteriche. Diluire serialmente 1:10 le sospensioni ottenute e inseminare in piastre Petri su terreni selettivi o identificativi specifici per ciascun gruppo microbico.

Escherichia coli

Bacillo Gram negativo della famiglia Enterobatteriaceae, anaerobio facoltativo e ossidasi negativo, tra i coliformi fecali di possibile presenza sui prodotti di quarta gamma, è considerato un indicatore della conformità igienica del processo di produzione e trasformazione. Il criterio microbiologico presente nell’allegato I del Reg. CE 1441/2007 prescrive per il prodotto in fase di lavorazione che in 2 unità campionarie su 5 analizzate i valori in ufc/g non dovranno superare 103.

Rilevamento

Norma ISO 16649-1 e 2. Metodi validati AFNOR.

Procedura descritta a http://www.cfsan.fda.gov/~ebam/bam-a2.html.

Nella pratica di laboratorio si può far ricorso a colture su terreni cromogeni validati con risposte ben correlate con quelle del protocollo standardizzato ISO 16649-2.

La sospensione microbica viene inoculata su terreno cromogenico per inclusione in doppio strato con agar batteriologico a 1 ml/piastra e le piastre così preparate vengono incubate in aerobiosi a 37 °C per 48 ore (a 42 °C è specifico solo per E. coli).

Coli ID (Biomerieux) è un terreno pronto per l’uso contenente beta-D-glucuronidasi, che permette l’identificazione contemporanea di coliformi (colonie blu beta-galattosidasi positive) ed E. coli (colonie fucsia beta-galattosidasi e beta-glucuronidasi positive).

TBX (Oxoid) è un terreno su cui le colonie di E.coli appaiono di colore blu.

Listeria monocytogenes

Bacillo gram positivo, mobile per flagelli, appartenente alla famiglia Listeriaceae.

Ecologia

I principali habitat sono il suolo, il foraggio, l’acqua, il fango e il foraggio fermentato. Listeria monocytogenes si trova anche nell’uomo e negli animali domestici e selvatici (mammiferi, uccelli e probabilmente anche alcune specie di pesci e molluschi). I vegetali vengono contaminati per contatto con mezzi inquinati.

Non produce spore, ma sopravvive bene all’essiccamento, al caldo e al freddo, moltiplicandosi anche a temperatura di frigorifero.

La contaminazione di vegetali freschi-pronti è un pericolo sanitario, soprattutto per i consumatori esposti con deficit immunitari, bambini e anziani.

Affezioni

La trasmissione avviene principalmente per via alimentare. Nelle persone suscettibili uno stato morboso è stato indotto da meno di mille cellule in infezioni contratte per consumo di latte crudo o pastorizzato in maniera inefficace.

Il batterio è in grado di invadere l’epitelio gastrointestinale e di penetrare e stabilirsi poi nei monociti (da cui il nome specifico), nei macrofagi e nei leucociti polimorfonucleati del sangue. La sua presenza intracellulare nei fagociti ne permette l’accesso anche al cervello e probabilmente il passaggio attraverso la membrana placentare.

La listeriosi si manifesta con meningite (o meningoencefalite), setticemia nei neonati e negli adulti, infezioni intrauterine o cervicali, che possono portare all’aborto nelle donne incinte. Le donne incinte, anche se asintomatiche, possono trasmettere l’infezione al feto, con la conseguenza di decessi intrauterini, bambini nati con setticemia o sviluppo di meningite in epoca neonatale. L’aborto avviene di solito nella seconda metà della gravidanza. L’infezione perinatale viene acquisita se la madre si infetta nell’ultimo trimestre.

I più suscettibili sono i feti, i neonati con meno di tre settimane di vita, gli anziani, i soggetti con deficienze immunitarie acquisite o indotte.

Rilevamento

Ricerca: IS0 11290-1; quantificazione: EN/IS0 11290-2.

I metodi tradizionali sono elaborati e lenti, richiedendo da 24 a 48 h di coltivazione (arricchimento) seguiti da altri saggi. Il tempo totale di identificazione varia da 5 a 7 giorni. L’utilizzo di specifiche sonde di DNA non marcate radioattivamente dovrebbe permettere in breve tempo e semplicemente di confermare gli isolati batterici sospetti. La tecnologia del DNA ricombinante in futuro potrebbe consentire un rilievo in 2-3 giorni.

Salmonella

Bacillo Gram negativo, spesso mobile, non sporigeno, aerobio-anaerobio facoltativo, della famiglia Enterobatteriacaee, affine a Shigella ed Escherichia. Il genere comprende circa 2400 sierotipidiversificati secondo l’antigene somatico O, l’antigene flagellare H e l’antigene di superficie Vi.

Oltre ai sierotipi, anche i fagi sono utilizzati per classificare le salmonelle. La variabilità fagica è utile in particolare per seguire l’andamento di un’epidemia se associata al profilo ottenuto con Pulsed Field Gel Electrophoresis (PFGE).

Ecologia

L’ambiente proprio delle salmonelle è l’intestino degli animali vertebrati. La sopravvivenza nell’ambiente esterno è limitata dalla competizione esercitata dagli altri microbi, dalla disponibilità di substrati e dalle condizioni ambientali (temperatura, salinità, pH, acqua libera).

La temperatura ottima di sviluppo è tra i 35 e i 37 °C, ma la moltiplicazione è possibile fino a 5 e 46 °C. Il pH compatibile è compreso tra 4 e 9,5.

La persistenza sui vegetali può essere dovuta alla capacità di associazione con altri microbi in biofilm, che potrebbe permettere di resistere in un ambiente ostile.

La presenza nell’acqua può derivare dalla continua contaminazione delle fonti per intrusione di acque luride.

Affezioni

La trasmissione avviene per via oro-fecale attraverso l’ingestione di cibo contaminato. La dose infettiva potrebbe essere molto bassa (15-20 cellule) secondo la FDA.

Una volta ingeriti, i batteri raggiungono l’intestino e si insediano nell’epitelio dell’intestino tenue, dove causano l’infiammazione del tessuto. Producono una tossina, forse all’interno dell’enterocita (cellula dell’epitelio intestinale) colonizzato. Esistono due tipi di malattie: quella tipicamente enterocolitica ed il tifo.

I sintomi della forma enterocolitica sono un improvviso mal di testa, dolori addominali (crampi), diarrea, nausea e a volte vomito, accompagnati quasi sempre da febbre. La disidratazione, dovuta alla perdita di liquidi, può essere grave soprattutto nei bambini piccoli e negli anziani.

Rilevamento

Nella produzione di ortaggi di quarta gamma la ricerca periodica di Salmonella è opportuna per monitorare il rischio di contaminazione ambientale, particolarmente dopo forti precipitazioni meteoriche che potrebbero aver determinato l’esondazione di canali di scolo.

Metodo di riferimento: norma EN/ISO 6579, 2002.

Il metodo di coltura richiede 5 giorni per risultati presuntivi.

1. Addizionare 25 g di campione a 225 mL di acqua peptonata tamponata ed incubare a 36+/-1°C per non meno di 16 ore e non più di 20 ore.

2. Trasferire 0,1 mL di coltura in 10 mL di Rappaport Vassiliadis Broth ed una seconda aliquota di coltura da 1 mL in 10 mL di Muller Kauffmann Broth contenente come supplemento Novobiocina

3. Incubare il terreno di Rappaport Vassiliadis Broth a 42 +/-1°C per 24 +/-3 ore; incubare le provette di Muller Kauffmann Broth contenenti come supplemento Novobiocina a 36+/-1°C per 24+/-3 ore.

4. Con un’ansa da 3 mm immersa nella provetta di di Rappaport Vassiliadis Broth, inoculare due piastre in cui è presente terreno selettivo per salmonelle. Caricare l’ansa una sola volta e seminare per strisci successivi le due piastre.

5. Allo stesso modo inoculare due piastre usando le brodo colture in Muller Kauffmann Broth contenente come supplemento Novobiocina.

6. Incubare le piastre a 36+/-1°C per 24+/-3 ore ed osservare per la presenza di colonie tipiche. Se si osservano crescite scarse o nessuna crescita, reincubare le piastre per altre 18-24 ore.

Microrganismi aerobi a 30°C

Questa microflora è rappresentata prevalentemente da batteri Gram negativi.

Rilevamento

Qualunque metodica scelta per affidabilità e precisione nel proprio sistema di autocontrollo.

Norma di riferimento ISO 4833 (2003)

Flora lattica

Microrganismi (batteri e lieviti) Gram positivi, anaerobi-microaerofili, che crescono a 30°C, presenti soprattutto su parti carnose in atmosfere a basso tenore di ossigeno.

Rilevamento

Norma ISO 13721 (1995) e qualunque metodo che si presti ad individuare la microflora lattica come definita.

Su MRS Agar acidificato con l’aggiunta di acido acetico glaciale (1,32 ml/l) è inoculato per inclusione con doppio strato e incubato a 30°C per 5 giorni e permette il conteggio e l’isolamento selettivo dei microbi lattici.

Aeromonas hydrophyla

Bacilli mobili e non mobili, non sporigeni, Gram-negativi, ossidasi positivi, anaerobi facoltativi, con molte caratteristiche biochimiche comuni con la famiglia Enterobactericeae, dalla quale si differenziano per la positività alla citocromossidasi. Alcuni ceppi di A. hydrophila causano malattie in pesci, anfibi ed mammiferi.

La normativa italiana sulla qualità delle acque potabili e dei cibi non considera questo microrganismo.

Ecologia

A. hydrophila è presente in ambienti acquatici e può contaminare i vegetali, sui quali può persistere dopo la trasformazione di quarta gamma grazie alla capacità di produrre biofilm e di sopravvivere a bassa temperatura e a bassa concentrazione di ossigeno.

La presenza nel sistema idrico tende ad aumentare nella stagione calda. Le autorità sanitarie olandesi raccomandano valori non superiori a 2000 unità formanti colonie per litro nelle acque distribuite e a 200 nelle acque alla fonte.

La sua presenza è stata rilevata anche in assenza di E. coli e senza rapporto con la presenza di indicatori di contaminazione fecale.

Affezioni

La patogenesi delle infezioni da Aeromonas non è stata sufficientemente chiarita, ma è noto che le specie mesofile possiedono numerosi fattori di virulenza, con meccanismi di adesione e produzione di numerose tossine, che sembrano principalmente favorire l’insediamento del microrganismo e la sua capacità di adesione e o di invasione.

L’espressione di fattori di virulenza, in alcuni casi, sembra influenzata dalle condizioni ambientali e stagionali. L’analisi molecolare ha fatto rilevare differenze tra genotipi rilevati nell’ambiente e quelli rilevati negli animali, che si infettano attraverso ferite aperte o tramite l’ingestione di un sufficiente numero di cellule batteriche (107 e 1010 ) con il cibo o l’acqua.

A. hydrophila può causare due tipi di gastroenteriti in persone sane, in particolare nei bambini molto piccoli, una simile a colera (febbre e feci acquose) e dissenteria, l’altra caratterizzata da infezioni extraintestinali (setticemia, meningiti, endocarditi, peritoniti, ulcerazioni corneali) in individui con sistema immunitario compromesso.

Rilevamento

Recupero da alimenti mediante piastramento diretto su un mezzo solido contenente amido come unica fonte di carboidrati e ampicillina per impedire la crescita della maggior parte dei microorganismsi competitori.

Recupero da feci o da sangue piastrando il microrganismo su un mezzo agarizzato contenente sangue di pecora e l’antibiotico ampicillina.

L’identificazione della specie può essere confermata da test biochimici.

Bacillus cereus

Bacillo Gram positivo, aerobio facoltativo e sporigeno, caratterizzato da motilità, presenza di cristalli di tossine, attività emolitica.

Ecologia

Presente nel suolo, può contaminare i vegetali. Viene spesso rinvenuto a bassa concentrazione nei cibi crudi, secchi e anche lavorati.

Affezioni

Bacillus cereus può produrre due malattie attraverso distinti prodotti metabolici (enterotossine): la diarrea accompagnata da coliche, dolori e crampi addominali è dovuta a un’enterotossina di alto peso molecolare sensibile al calore; vomito e nausea entro poche ore dopo il consumo di alimenti contaminati sono causati da un’enterotossina di basso peso molecolare stabile al calore.

L’infezione è trasmessa spesso consumando cibi tenuti a lungo a temperatura ambiente dopo la cottura.

La forma diarroica è stata associata a cibi non trattati correttamente come carni, latte, verdure e pesce e a cibi misti come salse, zuppe, budini, sformati, paste e insalate.

La forma con vomito è stata associata soprattutto a cibi a base di riso e in genere amidacei (patate, pasta).

Rilevamento

Attraverso rilevamento dell’enterotossina del tipo diarroico mediante metodi molecolari, e l’identificazione con culture cellulari della tossina che causa vomito.

Shigella

Bacillo Gram negativo, privo di motilità e asporigeno, della famiglia Enterobacteriaceae, come E. coli e Salmonella. Le quattro specie (S. dysenteriaeS. flexeneriS. boydii e S. sonnei) sono suddivise in sierotipi (rispettivamente 12, 13, 18 e 1) e sottotipi. I sierotipi sono indicati con numeri, i sottotipi con lettere.

Alcuni ceppi producono un enterotossina ed una tossina (shiga, molto simile alla verotossina di E. coli H7:O157).

Ecologia

Il batterio viene diffuso nell’ambiente da soggetti malati o portatori attraverso le feci.

La contaminazione dei vegetali è causata dal contatto con mezzi inquinati e dalle manipolazioni eseguite senza precauzioni igieniche.

Affezioni

La shigellosi è una dissenteria a livello dell’intestino crasso e tenue distale, determinata dalla penetrazione del batterio nelle cellule epiteliali della mucosa intestinale, e si manifesta con diarrea accompagnata febbre, nausea, a volte tossemia, crampi, tenesmo e a volte vomito. Dopo l’invasione i microbi si moltiplicano e si diffondono nelle cellule epiteliali contigue, con distruzione del tessuto. Le feci contengono sangue e muco, in conseguenza dei microascessi prodotti nell’epitelio intestinale.

La dose infettiva è piuttosto bassa (una decina di cellule). Bambini e anziani sono più suscettibili ed hanno sintomi più gravi.

La severità e la mortalità dipendono dall’ospite, soprattutto dallo stato nutrizionale, e dall’aggressività del sierotipo.

Rilevamento

Una parte del campione alimentare viene arricchito in un brodo selettivo contenente novobiocina e una sua aliquota viene in seguito piastrata su agar selettivo-differenziale. Gli isolati presunti di Shigella sono selezionati e identificati per via biochimica e sierologica. La scarsa sensibilità delle procedure di isolamento rende molto difficile dimostrare la presenza di Shigella nei campioni alimentari.

Conferma con metodi molecolari (PCR, sonda genica complementare al plasmide della virulenza).

Yersinia enterocolitica

Bacillo Gram negativo appartenente al gruppo enterico, con quattro sierotipi patogeni su 50 (O3, O8, O9, O5) e quattro biotipi patogeni (1, 2, 3, 4) su cinque.

Ecologia

Microrganismo intestinale di molti animali, che possono non mostrare alcun segno di malattia. Resistente al freddo è stato rilevato in isolati ambientali (laghi, stagni) e in cibi (gelati). Anche se spesso isolato da feci, ferite, linfonodi mesenterici e saliva umana, non fa parte della flora batterica normalmente presente nell’uomo.

La presenza negli animali e nell’ambiente può portare a contaminazioni dei vegetali.

Affezioni

La yersiniosi è una malattia enterica acuta che si presenta con improvvisa diarrea e febbre (soprattutto nei bambini più piccoli), dolori addominali, a volte vomito, linfoadenite mesenterica acuta simile ad appendicite. Possibili infezioni urinarie, delle ferite e delle articolazioni. La virulenza è conferita da un plasmide, di circa 70kb.

L’infezione del sangue è molto rara e può verificarsi nei bambini sotto i tre mesi di età.

Rilevamento

Y. enterocolitica può essere isolata abbastanza facilmente, ma può essere necessario un arricchimento. L’identificazione presuntiva richiede 36-48 ore. La conferma può richiedere 14-21 giorni o più. La determinazione della patogenicità è più complessa. I geni che codificano per l’invasione delle cellule di mammifero si trovano sul cromosoma mentre un plasmide di 40-50 MDa codifica per la maggior parte degli altri fenotipi associati alla virulenza. Questo plasmide è presente in quasi tutte le specie patogene di Yersinia, e i plasmidi sembrano essere omologhi.

E. coli O157:H7 e altri ceppi verocitotossici

E. coli in genere non causa malattie, ma alcuni cloni hanno acquisito la capacità patogenetiche (ceppi enteroemorragici, il cui capostipite è rappresentato dal sierotipo O157:H7, detti verocitoproduttori e indicati con gli acronimi STEC e VTEC).

Questi ceppi producono tossine di tipo shiga (ST), dette anche verocitotossine (VT), in grado di indurre un danno irreversibile quando inoculate sperimentalmente su monostrati di cellule VERO. STEC (Shiga like toxin E. coli) o VTEC (Verocitotoxin E. coli) sono sinonimi.

Ecologia

Il serbatoio principale di E. coli O157 è rappresentato dagli animali domestici, bovini in particolare. Gli alimenti vengono contaminati per contatto con mezzi inquinati dalle feci di animali infetti e rappresentano il principale veicolo di infezione per l’uomo.

L’infezione avviene attraverso l’ingestione di alimenti contaminati (carne macinata poco cotta, latte non pastorizzato, vegetali). La tolleranza agli acidi di E. coli O157 consente una lunga sopravvivenza anche negli alimenti acidi (insaccati e formaggi stagionati, yogurt, succo di mela, maionese, ecc.).

La trasmissione è possibile anche da persona a persona e mediante contatto diretto con gli animali escretori.

Affezioni

Il patotipo principale è rappresentato dal sierotipo O157:H7, ma anche altri sierotipi (O26:H11, O111:H8, O104:H21) sono stati implicati in focolai e casi sporadici di infezione

In alcuni casi l’affezione morbosa è stata attribuita a una decina di cellule batteriche, dose infettiva simile a quella riconosciuta per Shigella.

E. coli O157 aggredisce con due fattori: l’intimina e le verocitotossine (VTs). L’intimina è una proteina adesiva in grado di determinare delle particolari lesioni nelle cellule intestinali (enterociti), mentre le proteine VTs sono responsabili dei quadri sintomatologici più gravi, come la colite emorragica (CE) e la sindrome emolitico uremica (SEU), caratterizzata da insufficienza renale acuta e anemia emolitica che possono dare esito alla perdita della funzionalità renale. Un’altra grave complicazione è la porpora trombotica trombocitopenica (TTP), una forma di SEU accompagnata da febbre e sintomi neurologici, osservata più frequentemente negli adulti che nei bambini

Le infezioni da ceppi VTEC possono colpire persone di tutte le fasce di età, ma sono più gravi per le età estreme (bambini ed anziani).

Rilevamento

L’isolamento di E. coli O157 dagli alimenti risulta difficoltoso, perché la contaminazione è generalmente bassa e occorre utilizzare tecniche di concentrazione (immunoconcentrazione o separazione immunomagnetica). L’isolamento su terreni colturali solidi sfrutta l’incapacità di gran parte dei ceppi O157 di fermentare il sorbitolo o l’incapacità dei ceppi O26 di fermentare il ramnosio. Inoltre E. coli O157:H7 risulta negativo al saggio MUG. Per isolare selettivamente il microorganismo viene utilizzato il terreno Sorbitolo-MacConkey per campioni clinici e il mezzo colite emorragica, selettivo e differenziale, per campioni alimentari, applicando il metodo del piastramento diretto. Una terza procedura inizia con una fase di arricchimento cui segue l’impiego del terreno Sorbitolo-MacConkey addizionato di tellurite di potassio e di Cefixima. Un approccio molecolare ricerca i markers genetici di virulenza del microrganismo (eae, stx1, stx2), applicando le procedure di isolamento ai campioni positivi.

Campylobacter

Bacillo Gram negativo, stretto, ricurvo, dotato di motilità, microaerofilo, che si sviluppa solo a livelli di ossigeno ridotti. Sensibile all’aria e agli stress ambientali (secco, caldo, acidi). Si distinguono 18 specie, oltre a biotipi e sierotipi, ma è difficile differenziare ceppi non patogeni da patogeni, come sembrano molti degli isolati da pollame.

Ecologia

L’ambiente proprio è l’apparato digerente di animali (mammiferi, uccelli, insetti), anche asintomatici. Non è chiaro come avvenga la trasmissione nel pollo, ma non è provata una trasmissione attraverso le uova. Può trovarsi anche in riserve idriche. Le carni non ben cotte di polli e maiali e il latte crudo sono le principali fonti di infezione. I vegetali possono essere contaminati per contatto con mezzi inquinati e il batterio può persistere sui prodotti freschi imballati in atmosfera a basso tenore di ossigeno.

Affezioni

La trasmissione avviene per ingestione di cibi o acqua contaminati.

La patogenesi non è stata sufficientemente chiarita, ma si sa che il batterio produce una tossina sensibile al calore e può essere invasivo. La dose infettiva è considerata variabile, con un minimo di 400 cellule.

Campylobacter causa una enterite acuta, che si manifesta con diarrea, dolori addominali, malessere, febbre, nausea, vomito, mal di testa, dolori muscolari. La diarrea può essere acquosa o appiccicosa e può contenere sangue (di solito occulto) insieme a muco o leucociti. Può evolvere in una sindrome di tipo tifoide o artrite reattiva (associata a predisposizione genetica) o una sindrome euremica-emolitica. In rari casi si verifica setticemia.

Rilevamento

L’isolamento dai cibi è molto difficile perché i batteri sono presenti in scarsa quantità, mentre sono abbondanti nelle feci diarroiche. Altrettanto rari sono nei campioni ambientali (aria, acqua e suolo), data la sensibilità all’ossigeno. Il rilevamento è laborioso e lento, richiedendo un arricchimento in terreni selettivi, ridotta tensione di ossigeno (5% di ossigeno) e una temperatura di 43 °C.

Cryptosporidium parvum

Protozoo di piccole dimensioni (4-6 micron di diametro), parassita intracellulare obbligato del tratto intestinale dei mammiferi. Il ciclo biologico si svolge in un solo ospite ed è caratterizzato da un’alternanza di generazioni sessuate e asessuate. L’oocisti è di 3 micrometri di diametro, circa la metà delle dimensioni di un globulo rosso.

Ecologia

Varie specie di Cryptosporidium vivono nell’intestino di mammiferi, domestici e no, particolarmente ruminanti e rettili. L’infezione si verifica per via oro-fecale attraverso le oocisti sporulate. La sintomatologia morbosa si manifesta con l’invasione degli apici degli enterociti dell’ileo da parte dei sporozoiti e merozoiti. Le oocisti sono immediatamente contagiose e continuano a essere escrete per settimane dopo la scomparsa dei sintomi; sopravvivono per alcuni mesi nelle deiezioni animali e nelle acque e attraverso queste possono contaminare i vegetali freschi; sono molto resistenti ai disinfettanti a base di cloro, ma sono suscettibili all’essiccazione e alla radiazione ultravioletta. C. parvum è considerato il parassita acquatico più importante nei paesi temperati. I casi noti di infezioni massive sono prevalentemente collegati a uso di acqua contaminata, anche mediante balneazione.

Affezioni

L’infezione può essere prodotta da un minimo di 10 oocisti. Gli sporozoidi vengono rilasciati nell’intestino tenue e attaccano i microvilli delle cellule epiteliali, trasformandosi in trofozoidi e riproducendosi quindi per gemmazione multipla (schizogonia). I trofozoidi si sviluppano in meronti che rilasciano merozoidi, che direttamente o dopo ulteriori trasformazioni attaccano le cellule epiteliali, completando il ciclo con la formazione di macro e microgamonti (sessuati). I macrogamonti ricevono microgameti e producono zigoti, che evolvono in oocisti di due tipi: un tipo (minoritario) con pareti tenui che può reinfettare l’ospite e un tipo a pareti spesse che viene escreto nell’ambiente, dove può sopravvivere per mesi.

I sintomi sono diarrea (particolarmente grave nei soggetti con deficienze immunitarie, per i quali le perdite di liquidi possono raggiungere 10-15 litri/giorno, con rischio di vita), anoressia, nausea, vomito e dolori addominali. L’affezione si risolve spontaneamente nei soggetti immunocompetenti, con l’aiuto di reidratazione e antidiarroici (es. probiotico Saccharomyces boulardii).

Rilevamento

Analisi genomica (PCR) per identificazione specifica e microscopia in fluorescenza con kit commerciali (Hydrofluor Combo Detection Kit, utile anche per Giardia) per l’osservazione delle oocisti (http://www.cfsan.fda.gov/~ebam/bam-19a.html).

Virus dell’epatite A

Il virus dell’epatite A è un enterovirus nella famiglia Picornaviridae, con una singola molecola di RNA circondata da un piccolo capside proteico (27 nm di diametro).

Ecologia

La principale riserva del virus sono gli individui infetti. L’infezione è trasmessa per via oro-fecale, attraverso contaminazione dei cibi e dell’acqua. Il virus può sopravvivere per mesi in acque dolci e salate. Acqua, molluschi e crostacei sono le fonti alimentari più frequenti. Frequente la contaminazione di alimenti da lavoratori infetti in impianti di trasformazione alimentare e ristoranti. Diffusione prevalente in america centrale e meridionale, africa, medio ed estremo oriente. Sensibile a disinfettanti a base di cloro.

Affezioni

La dose infettiva è sconoscita ma presumibilmente è di 10-100 particelle. L’epatite A è di solito una malattia lieve, che si manifesta da due a sei settimane dopo l’infezione, caratterizzata da insorgenza improvvisa di febbre, malessere, nausea, anoressia, disturbi addominali e dopo molti giorni ittero. In alcuni soggetti, prevalentemente bambini, può essere asintomatica. Il sistema immuntario in genere reagisce bene, conferendo immunità verso infezioni successive. Prevenibile con vaccinazione.

Rilevamento

Il virus è difficile da individuare negli alimenti a causa della presenza di sostanze inibitorie e della bassa concentrazione di virus nella maggior parte dei campioni. Inoltre per il lungo periodo di incubazione, l’alimento sospetto spesso non è più disponibile per l’analisi. Attualmente non è disponibile nessun metodo soddisfacente per l’analisi di routine degli alimenti, per i quali si possono impiegare i metodi di analisi genomica (PCR) utilizzati per la rilevazione in acqua e in campioni clinici.

Virus Norwalk

Norwalk virus è il prototipo di una famiglia di virus con struttura piccola e rotonda non classificati (SRSVs) che possono essere correlati ai calicivirus. Contengono un genoma a singolo filamento di RNA positivo di 7,5 kb e una singola proteina strutturale di circa 60 kDa. Le particelle virali 27-32 nm. La famiglia si compone di diversi tipi distinti sierologicamente.

Ecologia

La principale riserva del virus sono gli individui infetti. L’infezione è trasmessa direttamente tra individui o attraverso contaminazione dei cibi e dell’acqua. Molluschi, crostacei e insalate sono tra i cibi più implicati nella trasmissione del virus, ritenuto causa del 90% delle gastroenteriti non batteriche a livello mondiale. Sensibile ai disinfettanti a base di cloro, ma alquanto resistente ad alcoli e detergenti.

Affezioni

La dose infettante non è nota, ma si presume bassa. Gastroenterite virale con nausea, vomito, diarrea, dolori addominali e muscolari, debolezza, letargia, occasionalmente mal di testa e febbre. L’affezione può diventare persistente e pericolosa nei soggetti deboli.

Rilevamento

L’analisi genomica (PCR) è molto sensibile e fornisce risultati in poche ore. Il recupero dei virus dalla matrice alimentare deve essere ulteriormente perfezionato per un più efficiente distacco delle particelle virali dai diversi substrati da analizzare e anche in considerazione della differente struttura dei virus che possono essere adsorbiti alla matrice. I metodi immunologici sono poco specifici e poco sensibili.

Giardia lamblia

Nota anche come G. intestinalis e G. duodenalis, è un organismo unicellulare (Protozoi flagellati diplomonadini) che si muove con l’aiuto di cinque flagelli, parassita dell’intestino tenue di vari mammiferi (in particolare dei primati e del maiale). Si conoscono diversi ceppi, caratterizzati in base al polimorfismo proteico. Il ciclo vitale comporta due forme: cisti immobili e infettive, resistenti al trattamento con acqua clorata, che possono sopravvivere diversi mesi in condizioni ambientali freddo-umide e producono due trofozoidi ciascuna, mobili e non infettivi, perché non sopravvivono a lungo fuori del corpo ospite.

Ecologia

Oltre ai mammiferi, piccoli animali acquatici fungono da ospiti di riserva delle cisti. La giardiasi è prevalentemente dovuta all’ingestione di cisti mediante consumo di acqua contaminata (spesso proveniente da sistemi che non utilizzano una filtrazione efficiente) o di cibi contaminati per manipolazioni di individui infetti. La produzione di trofozoidi nell’intestino è favorita dal passaggio delle cisti nell’ambiente acido dello stomaco. I trofozoidi causano la sintomatologia morbosa perché si attaccano alla mucosa intestinale con dischi ventrali succhiatori. In genere non sono invasivi, ma a volte penetrano nei tubuli secretori della mucosa e possono finire nel sistema biliare. La giardiasi è diffusa prevalentemente nella zona tropicale e subtropicale, ma è presente anche nelle zone temperate e in paesi con sistemi idrici meglio controllati. Negli Stati Uniti è l’affezione protozoaria più rilevata.

Dose infettiva

L’ingestione di poche cisti può causare malattia.

Affezioni

Prevalentemente di tipo enterico, entro una settimana dall’ingestione delle cisti: crampi, diarrea senza dissenteria, vomito, eruttazione, alito puzzolente, flatulenza, e febbre per 3-4 giorni, seguite da una fase meno acuta in alcuni individui; sintomi più graduali che possono scomparire o divenire ricorrenti nella maggior parte degli individui infetti. Sintomi a livello costituzionale sono anoressia e stanchezza, accompagnate da perdita di peso, intolleranza a lattosio, manifestazioni allergiche (eritema, broncospasmo, orticaria, affezioni del tratto biliare). Possibilità di cronicizzare in alcuni individui. A livello fisico può verificarsi disidratazione.

Rilevamento

Anticorpi immunofluorescenti (Giardia-cell FITC stain, Cellabs) e saggi ELISA per rilevare la presenza di cisti.